Ключевое различие между обычными методами гнездовой ПЦР и ПЦР в реальном времени заключается в том, что обычная ПЦР представляет собой метод, разработанный для амплификации определенных последовательностей ДНК, а вложенная ПЦР представляет собой модификацию обычной ПЦР, состоящую из двух последовательных реакций амплификации, в то время как настоящая ПЦР во времени - это вариант традиционной ПЦР, позволяющий количественно определить амплифицированный продукт.
ПЦР - очень распространенный научный метод, широко используемый в исследованиях и медицине для обнаружения ДНК. ПЦР-тесты используются для обнаружения антигенов путем обнаружения их ДНК или РНК. Как правило, вирусная РНК присутствует в организме до обнаружения антител или проявления симптомов заболевания. ПЦР-тест может определить, есть ли у кого-то вирус на ранней стадии. В настоящее время ПЦР является стандартным тестом для выявления заболевания COVID-19. Существуют различные типы методов ПЦР, такие как ПЦР в реальном времени, вложенная ПЦР, мультиплексная ПЦР, ПЦР с горячим стартом и ПЦР дальнего действия и т. д.
Что такое обычные ПЦР-тесты?
Обычный анализ ПЦР - это метод амплификации ДНК in vitro, обычно применяемый в молекулярно-биологических лабораториях. Этот метод позволял производить от тысяч до миллионов копий определенного фрагмента ДНК. Кэри Маллис представил этот метод в 1980 году. Для этого метода требуется фрагмент ДНК, известный как матрица, чтобы сделать много копий. Taq-полимераза работает как фермент ДНК-полимеразы и катализирует синтез новых цепей матричной последовательности.
Праймеры в смеси для ПЦР будут служить отправными точками для удлинения фрагментов. Все ингредиенты, необходимые для создания копий ДНК, включены в смесь для ПЦР. Реакция ПЦР проводится на машине для ПЦР, и в нее следует подавать правильную смесь для ПЦР и правильную программу ПЦР. Если реакционная смесь и программа верны, она произведет необходимое количество копий определенного участка ДНК из очень небольшого количества ДНК.
Рисунок 01: Обычный анализ ПЦР
В реакции ПЦР участвуют три основных этапа: денатурация, отжиг праймеров и удлинение цепи. Эти три стадии происходят при трех различных температурах. Буфер ПЦР поддерживает оптимальные условия для действия полимеразы Taq. Эти три стадии реакции ПЦР повторяются для получения необходимого количества продукта ПЦР. При каждой реакции ПЦР количество копий ДНК удваивается. Следовательно, в ПЦР можно наблюдать экспоненциальную амплификацию. Продукт ПЦР можно разделить с помощью гель-электрофореза, поскольку он дает видимое количество ДНК на геле, и его можно очистить для дальнейших исследований, таких как секвенирование.
ПЦР является ценным инструментом в медицинских и биологических исследованиях. Особенно в криминалистических исследованиях ПЦР имеет огромное значение, поскольку она может амплифицировать ДНК для исследований из крошечных образцов преступников и составлять криминалистические профили ДНК. ПЦР широко используется во многих областях молекулярной биологии, включая генотипирование, клонирование генов, обнаружение мутаций, секвенирование ДНК, ДНК-микрочипы и тестирование на отцовство.
Что такое тесты вложенной ПЦР?
Вложенная ПЦР - это тип ПЦР, снижающий неспецифическую амплификацию ДНК. В анализе вложенной ПЦР есть две последовательные ПЦР или две последовательные реакции амплификации. В ходе первой реакции амплификации образуется продукт ПЦР. После первой реакции проводят вторую реакцию амплификации продукта ПЦР первой реакции. Следовательно, праймеры во второй реакционной смеси связываются с первым продуктом ПЦР и амплифицируют его.
Рисунок 02: Вложенный PCR
Пары праймеров в каждой реакции разные. В гнездовой ПЦР снижается неспецифическое связывание праймеров. Гнездовые ПЦР полезны для повышения чувствительности и/или специфичности. Однако вложенная ПЦР требует знания интересующей последовательности.
Что такое ПЦР в реальном времени?
ПЦР в реальном времени или количественная ПЦР (Q-ПЦР) представляет собой модифицированную версию ПЦР, которая количественно измеряет продукты ПЦР. Таким образом, этот метод количественно определяет амплификацию в реальном времени с использованием машины для ПЦР в реальном времени. Это также подходящий метод для определения количества целевой последовательности или гена, присутствующего в образце.
Интересной особенностью ПЦР в реальном времени является то, что она объединяет как амплификацию, так и истинный количественный анализ в один этап. Поэтому необходимость в гель-электрофорезе для обнаружения может быть устранена с помощью метода ПЦР в реальном времени. Использование флуоресцентных красителей для маркировки продуктов ПЦР во время реакций ПЦР в конечном итоге приведет к прямому количественному определению. Когда продукты ПЦР накапливаются, флуоресцентные сигналы также накапливаются, и они будут измеряться машиной в реальном времени. SYBR Green и Taqman - это два метода обнаружения или наблюдения за процессом амплификации ПЦР в реальном времени. Оба метода отслеживают ход процесса амплификации и сообщают о количестве продукта в режиме реального времени.
Рисунок 03: ПЦР в реальном времени
ПЦР в реальном времени имеет широкий спектр применений, таких как количественная оценка экспрессии генов, анализ микроРНК и некодирующих РНК, генотипирование SNP, обнаружение вариантов числа копий, обнаружение редких мутаций, обнаружение генетически модифицированных организмов и обнаружение инфекционных агентов.
Каковы сходства между обычными вложенными анализами и ПЦР в реальном времени?
- Вложенные анализы и ПЦР в реальном времени являются модификациями обычного ПЦР.
- Все три метода амплифицируют образцы ДНК.
- Их продукты можно использовать для секвенирования или анализа.
- Для этих анализов требуются праймеры.
В чем разница между обычными вложенными анализами и ПЦР в реальном времени?
Традиционная ПЦР - это метод, разработанный для амплификации определенных последовательностей ДНК. Между тем, вложенная ПЦР - это модификация обычной ПЦР, состоящая из двух последовательных реакций амплификации, а ПЦР в реальном времени - это вариант обычной ПЦР, способный количественно определять амплифицированный продукт. Итак, в этом ключевое различие между обычными вложенными анализами и ПЦР в реальном времени. В отличие от обычной ПЦР и ПЦР в реальном времени, вложенная ПЦР использует два набора праймеров. Более того, во вложенной ПЦР есть две последовательные реакции амплификации, чтобы уменьшить неспецифическую амплификацию. кроме того, традиционная ПЦР и ПЦР в реальном времени не содержат двух последовательных реакций амплификации.
В следующей инфографике перечислены различия между обычными вложенными анализами и ПЦР в реальном времени в табличной форме для параллельного сравнения.
Резюме – Традиционные, вложенные и ПЦР в реальном времени анализы
Традиционная ПЦР - это первая методика, разработанная для амплификации специфических фрагментов ДНК. Вложенная ПЦР и ПЦР в реальном времени являются двумя вариантами обычной ПЦР. Есть две последовательные реакции амплификации и использование двух наборов праймеров во вложенной ПЦР. ПЦР в реальном времени разработана для количественного определения амплифицированного продукта ПЦР. Таким образом, это суммирует разницу между обычными вложенными анализами и ПЦР в реальном времени.
