Ключевая разница – NGS и секвенирование по Сэнгеру
Секвенирование следующего поколения (NGS) и секвенирование по Сэнгеру - это два типа методов секвенирования нуклеотидов, разработанных с течением времени. Метод секвенирования по Сэнгеру широко использовался в течение многих лет, и NGS недавно заменил его из-за его преимуществ. Ключевое различие между NGS и секвенированием по Сэнгеру заключается в том, что NGS работает по принципу одновременного секвенирования миллионов последовательностей быстрым способом с помощью системы секвенирования, в то время как секвенирование по Сэнгеру работает по принципу обрыва цепи за счет селективного включения дидезоксинуклеотидов ферментом ДНК-полимеразой. во время репликации ДНК и разделения полученных фрагментов методом капиллярного электрофореза.
Что такое секвенирование нуклеотидов?
Генетическая информация хранится в нуклеотидных последовательностях ДНК или РНК организма. Процесс определения правильного порядка нуклеотидов (с использованием четырех оснований) в данном фрагменте (в гене, кластере генов, хромосоме и полном геноме) известен как секвенирование нуклеотидов. В геномных исследованиях, криминалистике, вирусологии, биологической систематике, медицинской диагностике, биотехнологии и во многих других областях очень важно анализировать структуру и функцию генов. Существуют различные типы методов секвенирования, разработанные учеными. Среди них секвенирование по Сэнгеру, разработанное Фредериком Сэнгером в 1977 году, широко использовалось и популяризировалось в течение длительного периода времени, пока его не заменило секвенирование следующего поколения.
Что такое NGS?
Секвенирование следующего поколения (NGS) - это термин, используемый для обозначения современных высокопроизводительных процессов секвенирования. В нем описывается ряд различных современных технологий секвенирования, которые произвели революцию в геномных исследованиях и молекулярной биологии. К этим методам относятся секвенирование Illumina, секвенирование Roche 454, секвенирование Ion Proton и секвенирование SOLiD (секвенирование путем обнаружения олиголигирования). Системы NGS быстрее и дешевле. В системах NGS используются четыре основных метода секвенирования ДНК, а именно; пиросеквенирование, секвенирование путем синтеза, секвенирование путем лигирования и ионно-полупроводниковое секвенирование. Параллельно можно секвенировать большое количество нитей ДНК или РНК (миллионы). Это позволяет секвенировать весь геном организмов за короткий период времени, в отличие от секвенирования по Сэнгеру, которое требует больше времени.
NGS имеет много преимуществ по сравнению с традиционным методом секвенирования Сэнгера. Это высокоскоростной, более точный и экономичный процесс, который можно выполнять с небольшим объемом выборки. NGS можно использовать в метагеномных исследованиях, при обнаружении вариаций в индивидуальном геноме из-за вставок и делеций и т. д., а также при анализе экспрессии генов.
Рисунок_1: Развитие секвенирования NGS
Что такое секвенирование по Сэнгеру?
Секвенирование по Сэнгеру - это метод секвенирования, разработанный Фредериком Сэнгером и его коллегами в 1977 году для определения точного порядка нуклеотидов в данном фрагменте ДНК. Он также известен как секвенирование обрыва цепи или дидезокси-секвенирование. Принцип работы этого метода заключается в прекращении синтеза цепи путем селективного включения дидезоксинуклеотидов, обрывающих цепь (ddNTP), таких как ddGTP, ddCTP, ddATP и ddTTP, с помощью ДНК-полимеразы во время репликации ДНК. Нормальные нуклеотиды имеют 3'-группы ОН для образования фосфодиэфирной связи между соседними нуклеотидами для продолжения формирования цепи. Однако в ddNTP отсутствует эта 3'-ОН-группа, и они не способны образовывать фосфодиэфирные связи между нуклеотидами. Следовательно, удлинение цепи прекращается.
В этом методе одноцепочечная ДНК, подлежащая секвенированию, служит матричной цепью для синтеза ДНК in vitro. Другими требованиями являются олигонуклеотидный праймер, предшественники дезоксинуклеотидов и фермент ДНК-полимераза. Когда известны фланкирующие концы целевого фрагмента, можно легко сконструировать праймеры для репликации ДНК. Четыре отдельные реакции синтеза ДНК проводят в четырех отдельных пробирках. Каждая пробирка имеет отдельные ddNTP вместе с другими требованиями. Из конкретного нуклеотида добавляют смесь dNTP и ddNTP. Точно так же проводят четыре отдельные реакции в четырех пробирках с четырьмя смесями. После реакций выполняется обнаружение фрагментов ДНК и преобразование паттерна фрагмента в информацию о последовательности. Полученные фрагменты ДНК денатурируют нагреванием и разделяют с помощью гель-электрофореза. Если используются радиоактивные нуклеотиды, рисунок полос в полиакриламидном геле можно визуализировать с помощью авторадиографии. Когда в этом методе используются дидезоксинуклеотиды с флуоресцентной меткой, его можно уменьшить при чтении геля и пропустить через луч лазера для обнаружения флуоресцентным детектором. Чтобы избежать ошибок, которые могут возникнуть, когда последовательность считывается на глаз и вводится вручную в компьютер, этот метод был разработан для использования автоматического секвенсора, связанного с компьютером.
Это метод, используемый для секвенирования ДНК в рамках проекта «Геном человека». Этот метод все еще используется с расширенными модификациями, потому что он дает точную информацию о последовательности, несмотря на то, что это дорогой и медленный процесс.
Рисунок_2: Секвенирование по Сэнгеру
В чем разница между NGS и секвенированием по Сэнгеру?
NGS против секвенирования по Сэнгеру |
|
| Секвенирование следующего поколения (NGS) относится к современным высокопроизводительным процессам секвенирования. В нем описывается ряд различных современных технологий секвенирования | Секвенирование по Сэнгеру - это метод секвенирования, разработанный Фредериком Сэнгером для определения точного порядка нуклеотидов в данном фрагменте ДНК. |
| Экономическая эффективность | |
| NGS является более дешевым процессом, поскольку он сокращает время, рабочую силу и химикаты. | Это дорогостоящий процесс, потому что он требует времени, человеческих усилий и большего количества химикатов. |
| Скорость | |
| Это происходит быстрее, так как и химическое обнаружение, и обнаружение сигналов многих нитей происходят параллельно. | Это занимает много времени, так как химическое обнаружение и обнаружение сигнала происходят как два отдельных процесса, и одновременно можно считывать только на нити. |
| Надежность | |
| NGS надежен. | Секвенирование по Сэнгеру менее надежно |
| Объем выборки | |
| NGS требует меньше ДНК. | Для этого метода требуется большое количество шаблонной ДНК. |
| Основание ДНК на секвенированный фрагмент | |
| Количество оснований ДНК на секвенируемый фрагмент меньше, чем по методу Сэнгера | Генерируемые последовательности длиннее, чем последовательности NGS. |
Резюме – NGS против секвенирования по Сэнгеру
NGS и секвенирование по Сэнгеру - это методы секвенирования нуклеотидов, широко используемые в молекулярной биологии. Секвенирование по Сэнгеру - это ранний метод секвенирования, который был заменен NGS. Основное различие между NGS и секвенированием по Сэнгеру заключается в том, что NGS - это высокоскоростной, более точный и экономичный процесс, чем секвенирование по Сэнгеру. Оба метода вызвали крупные вспышки в области генетики и биотехнологии.
