Ключевая разница - секвенирование Максама Гилберта и Сэнгера
Нуклеотиды являются основными структурными единицами и строительными блоками ДНК. Молекула ДНК состоит из полинуклеотидной цепи. В ДНК обнаружено четыре разных нуклеотида. Эти нуклеотиды состоят из четырех различных азотистых оснований, называемых А (аденин), G (гуанин), С (цитозин), Т (тимин). Порядок расположения нуклеотидов в молекуле ДНК имеет большое значение, поскольку он кодирует важную генетическую информацию для роста и развития организмов. Секвенирование ДНК относится к процессу, который определяет точную последовательность нуклеотидов ДНК. Существуют различные методы секвенирования ДНК. Секвенирование Максама Гилберта и секвенирование ДНК по Сэнгеру - это два метода секвенирования ДНК, которые относятся к секвенированию первого поколения. Процедура секвенирования Максама Гилберта определяет последовательность оснований путем химического расщепления 5'-концевых меченых фрагментов ДНК преимущественно по каждому из четырех нуклеотидов и гель-электрофореза. Процедура секвенирования по Сэнгеру определяет последовательность нуклеотидов путем синтеза одноцепочечной ДНК с использованием ДНК-полимеразы и дидезоксинуклеотидов и гель-электрофореза. В этом ключевое различие между Максамом Гилбертом и секвенированием по Сэнгеру.
Что такое секвенирование Максама Гилберта?
Секвенирование Максама Гилберта, также известное как метод химического секвенирования, представляет собой метод, разработанный для определения порядка нуклеотидов в ДНК. Этот метод был представлен Уолтером Гилбертом и Аланом Максамом в 1976 году и стал популярным, поскольку его можно проводить непосредственно с очищенной ДНК. Метод Максама Гилберта относится к первому поколению секвенирования ДНК, и это был первый метод секвенирования, широко используемый учеными.
Основной принцип этого метода заключается в рестрикции меченых на концах фрагментов ДНК по определенным основаниям химическими веществами и условиями, специфичными для оснований, и разделении меченых фрагментов с помощью электрофореза, как показано на рисунке 01. Фрагменты разделяются в соответствии с до их размеров на геле. Поскольку фрагменты помечены, последовательность молекулы ДНК можно легко вывести.
Метод Максама Гилберта использует специальные химические вещества для разрушения ДНК по определенным основаниям. Два распространенных химических вещества, называемых диметилсульфатом и гидразином, используются для селективной атаки на пурины и пиримидины соответственно.
Метод секвенирования Максама Гилберта выполняется в несколько этапов следующим образом.
- Очистка последовательности ДНК с использованием эндонуклеаз рестрикции
- Мечение концов фрагментов ДНК добавлением радиоактивных фосфатов
- Очистка меченых фрагментов от немеченых с помощью гель-электрофореза
- Разделение ДНК с концевой меткой на четыре пробирки и обработка специальными химическими веществами по отдельности
- Электрофорез содержимого каждой пробирки по отдельным линиям на геле и разделение фрагментов по их длине.
- Выявление фрагментов радиоавтографом.
Рисунок 01: секвенирование Максама Гилберта
Что такое секвенирование по Сэнгеру?
Секвенирование по Сэнгеру - это метод секвенирования, разработанный Фредериком Сэнгером и его коллегами в 1977 году для определения последовательности оснований данного фрагмента ДНК. Он также известен как метод секвенирования обрыва цепи или метод дидеокси-секвенирования. Этот метод работает по принципу селективного включения дидезоксинуклеотидов, обрывающих цепь (ddNTP), таких как ddGTP, ddCTP, ddATP и ddTTP, с помощью ДНК-полимеразы во время синтеза одноцепочечной ДНК для обрыва образования цепи. В дидезоксинуклеотидах отсутствуют 3'-ОН группы для образования фосфодиэфирных связей с соседними нуклеотидами. Следовательно, формирование нити останавливается, как только ddNTP включается во вновь формирующуюся нить во время секвенирования по Сэнгеру.
В этом методе четыре отдельные реакции синтеза ДНК (ПЦР) проводятся в четырех отдельных пробирках с одним типом ddNTP. К пробиркам для ПЦР также предъявляются другие требования, включая праймеры, dNTP, полимеразу Taq, особые условия и т. д. Четыре отдельные реакции проводятся в четырех пробирках с четырьмя смесями. После реакции ПЦР полученные фрагменты ДНК денатурируют нагреванием и разделяют с помощью гель-электрофореза. Затем фрагменты визуализируют с помощью меченого (радиоактивного или флуоресцентного) праймера или dNTP, как показано на рисунке 02.
Рисунок 02: Секвенирование по Сэнгеру
В чем разница между Максамом Гилбертом и секвенированием по Сэнгеру?
Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing |
|
| Секвенирование Максама Гилберта - первая методика, разработанная для секвенирования ДНК. | Метод секвенирования по Сэнгеру был введен после метода секвенирования Максама Гилберта. |
| Использование | |
| Этот метод используется редко. | Секвенирование по Сэнгеру обычно используется для секвенирования. |
| Использование опасных химических веществ | |
| В нем используются опасные химические вещества. | Использование опасных химикатов ограничено по сравнению с методом Максама Гилберта. |
| Маркировка для обнаружения | |
| В этом методе для мечения концов фрагментов ДНК используется радиоактивный P32. | Секвенирование по Сэнгеру использует радиоактивно или флуоресцентно меченные ddNTP. |
Резюме – Максам Гилберт против секвенирования Сэнгера
Секвенирование Максама Гилберта и Сэнгера - это два типа методов секвенирования ДНК, которые относятся к секвенированию ДНК первого поколения. Секвенирование Максама Гилберта - это первый метод секвенирования ДНК, представленный в 1976 году, и он выполняется путем разрыва фрагментов ДНК с мечеными концами с помощью химических веществ, специфичных для оснований. Следовательно, это известно как химическое секвенирование. Метод секвенирования по Сэнгеру был представлен в 1977 году и основан на реакциях обрыва цепи, управляемых ddNTP. Метод секвенирования по Сэнгеру популярнее, чем метод Максама Гилберта, из-за ряда недостатков метода Максама Гилберта, таких как чрезмерные затраты времени, использование опасных химических веществ и т. д. В этом разница между секвенированием Максама Гилберта и Сэнгера.
