Ключевая разница - секвенирование по Сэнгеру и пиросеквенирование
Секвенирование ДНК очень важно для анализа ДНК, поскольку знание правильного расположения нуклеотидов в конкретном участке ДНК дает много важной информации о нем. Существуют различные методы секвенирования ДНК. Секвенирование по Сэнгеру и пиросеквенирование - два разных метода секвенирования ДНК, широко используемые в молекулярной биологии. Ключевое различие между секвенированием по Сэнгеру и пиросеквенированием заключается в том, что при секвенировании по Сэнгеру используются дидезоксинуклеотиды для прекращения синтеза ДНК для чтения нуклеотидной последовательности, в то время как пиросеквенирование обнаруживает высвобождение пирофосфата путем включения нуклеотидов и синтеза комплементарной последовательности для считывания точного порядка последовательности.
Что такое секвенирование по Сэнгеру?
Секвенирование по Сэнгеру - это метод секвенирования ДНК первого поколения, разработанный Фредериком Сэнгером и его коллегами в 1977 году. Он также известен как секвенирование с обрывом цепи или дидеокси-секвенирование, поскольку основан на обрыве цепи дидезоксинуклеотидами (ddNTP). Этот метод широко использовался более 30 лет, пока не было разработано секвенирование нового поколения (NGS). Техника секвенирования по Сэнгеру позволила обнаружить правильный порядок нуклеотидов или присоединение определенного фрагмента ДНК. Он основан на селективном включении ddNTP и прекращении синтеза ДНК во время репликации ДНК in vitro. Отсутствие 3'-ОН-групп для продолжения образования фосфодиэфирной связи между соседними нуклеотидами является уникальной особенностью ddNTP. Следовательно, как только ddNTP присоединяется, удлинение цепи прекращается и заканчивается с этой точки. В секвенировании по Сэнгеру используются четыре ddNTP - ddATP, ddCTP, ddGTP и ddTTP. Эти нуклеотиды останавливают процесс репликации ДНК, когда они включаются в растущую цепь ДНК, что приводит к образованию коротких ДНК разной длины. Капиллярный гель-электрофорез используется для упорядочения этих коротких цепей ДНК по их размерам в геле, как показано на рисунке 01.
Рисунок 1: Капиллярный гель-электрофорез синтезированной короткой ДНК
Для репликации ДНК in vitro необходимо обеспечить несколько требований. Это фермент ДНК-полимераза, матричная ДНК, олигонуклеотидные праймеры и дезоксинуклеотиды (dNTP). При секвенировании по Сэнгеру репликация ДНК выполняется в четырех отдельных пробирках вместе с четырьмя типами ddNTP по отдельности. Дезоксинуклеотиды не полностью заменены соответствующими ddNTP. Смесь определенного dNTP (например, dATP + ddATP) помещают в пробирку и реплицируют. Четыре отдельных пробирочных продукта анализируют на геле в четырех отдельных лунках. Затем, читая гель, можно построить последовательность, как показано на рисунке 02.
Рисунок 02: Секвенирование по Сэнгеру
Секвенирование по Сэнгеру - важный метод, помогающий во многих областях молекулярной биологии. Проект генома человека был успешно завершен с помощью методов, основанных на секвенировании Сэнгера. Секвенирование по Сэнгеру также полезно при секвенировании целевой ДНК, исследованиях рака и генетических заболеваний, анализе экспрессии генов, идентификации человека, обнаружении патогенов, секвенировании микробов и т. д.
Секвенирование по Сэнгеру имеет несколько недостатков:
- Длина секвенируемой ДНК не может превышать 1000 пар оснований
- За один раз можно секвенировать только одну цепь.
- Это трудоемкий и дорогостоящий процесс.
Поэтому со временем были разработаны новые передовые методы секвенирования для преодоления этих проблем. Тем не менее, секвенирование по Сэнгеру все еще используется из-за его высокоточных результатов для фрагментов длиной примерно до 850 пар оснований.
Что такое пиросеквенирование?
Пиросеквенирование - это новый метод секвенирования ДНК, основанный на «секвенировании путем синтеза». Этот метод основан на обнаружении высвобождения пирофосфата при включении нуклеотида. В этом процессе задействованы четыре различных фермента: ДНК-полимерза, АТФ-сульфурилаза, люцифераза и апираза, а также два субстрата - аденозин-5'-фосфосульфат (АФС) и люциферин..
Процесс начинается со связывания праймера с одноцепочечной ДНК-матрицей, а ДНК-полимераза начинает включение комплементарных ей нуклеотидов. Когда нуклеотиды соединяются вместе (полимеризация нуклеиновых кислот), они высвобождают пирофосфатные группы (две фосфатные группы, связанные вместе) и энергию. Каждое добавление нуклеотида высвобождает эквимолярное количество пирофосфата. Пирофосфат превращается в АТФ с помощью АТФ-сульфурилазы в присутствии субстрата АПС. Генерируемый АТФ запускает опосредованное люциферазой превращение люциферина в оксилюциферин, производя видимый свет в количествах, пропорциональных количеству АТФ. Свет обнаруживается устройством обнаружения фотонов или фотоумножителем и создает пирограмму. Апираза расщепляет АТФ и невключенные dNTP в реакционной смеси. Добавление dNTP выполняется один раз за раз. Поскольку добавление нуклеотида известно по включению и обнаружению света, можно определить последовательность матрицы. Пирограмма используется для создания нуклеотидной последовательности образца ДНК, как показано на рисунке 03.
Пиросеквенирование очень важно при анализе полиморфизма одиночных нуклеотидов и секвенировании коротких участков ДНК. Высокая точность, гибкость, простота автоматизации и параллельная обработка являются преимуществами пиросеквенирования по сравнению с методами секвенирования по Сэнгеру.
Рисунок 03: Пиросеквенирование
В чем разница между секвенированием по Сэнгеру и пиросеквенированием?
Секвенирование по Сэнгеру и пиросеквенирование |
|
| Секвенирование по Сэнгеру - это метод секвенирования ДНК, основанный на селективном включении ddNTP ДНК-полимеразой и обрыве цепи. | Пиросеквенирование - это метод секвенирования ДНК, основанный на обнаружении высвобождения пирофосфата при включении нуклеотида. |
| Использование ddNTP | |
| ddNTP используются для прекращения репликации ДНК | ddNTP не используются. |
| Участвующие ферменты | |
| ДНК-полимераза используется. | Используются четыре фермента: ДНК-полимераза, АТФ-сульфурилаза, люцифераза и апираза. |
| Использованные подложки | |
| АПС и люциферин не используются. | Используются аденозин 5’ фосфосульфат (АФС) и люциферин. |
| Максимальная температура | |
| Это медленный процесс. | Это быстрый процесс. |
Резюме – Секвенирование по Сэнгеру и пиросеквенирование
Секвенирование по Сэнгеру и пиросеквенирование - два метода секвенирования ДНК, используемые в молекулярной биологии. Секвенирование по Сэнгеру строит порядок нуклеотидов в последовательности путем прекращения удлинения цепи, в то время как пиросеквенирование строит точный порядок нуклеотидов в последовательности путем включения нуклеотидов и обнаружения высвобождения пирофосфатов. Таким образом, основное различие между секвенированием по Сэнгеру и пиросеквенированием заключается в том, что секвенирование по Сэнгеру работает с секвенированием путем обрыва цепи, в то время как пиросеквенирование работает с секвенированием путем синтеза.
