Ключевая разница - SYBR Green против Taqman
SYBR Green и Taqman - это два метода, используемые для обнаружения или наблюдения за процессом амплификации ПЦР в реальном времени. SYBR Green - это метод, основанный на интеркалировании красителя, окрашивающего нуклеиновые кислоты, тогда как Taqman - это метод, основанный на гидролизе зонда. Обе технологии предназначены для генерации флуоресценции во время ПЦР, что позволяет ПЦР-машине в реальном времени отслеживать реакцию в «реальном времени». Метод SYBR Green проводится с использованием флуоресцентного красителя под названием SYBR green и обнаруживает амплификацию путем связывания красителя с полученной двухцепочечной ДНК. Taqman проводится с использованием зондов с двойной меткой и обнаруживает амплификацию путем деградации зонда Taq-полимеразой и высвобождения флуорофора. В этом ключевое отличие SYBR Green от Taqman.
Что такое SYBR Green?
SYBR Green - это флуоресцентный краситель, используемый для окрашивания нуклеиновых кислот, особенно двухцепочечной ДНК, в молекулярной биологии. Метод SYBR Green используется для количественного определения продуктов ПЦР во время ПЦР в реальном времени. Как только он связывается с ДНК, полученный комплекс ДНК-краситель поглощает синий свет и излучает интенсивный зеленый свет. Это происходит из-за структурного изменения, происходящего в молекуле красителя при связывании с двухцепочечной ДНК. Когда ПЦР создает все больше и больше ДНК, большее количество молекул красителя связывается с ДНК, создавая более сильную флуоресценцию. Следовательно, флуоресценция увеличивается по мере накопления продукта ПЦР. Таким образом, количество продукта ПЦР можно количественно измерить с помощью флуоресцентного детектора SYBR Green.
Зеленый краситель SYBR также можно использовать для мечения ДНК в цитометрии и флуоресцентной микроскопии. Бромид этидия был успешно заменен на SYBR Green, поскольку бромид этидия является канцерогенным красителем, и его утилизация при визуализации ДНК в гель-электрофорезе вызывает проблемы.
Есть преимущества и недостатки зеленого метода SYBR. Этот метод очень чувствителен, недорог и прост в использовании. Однако из-за его способности связываться с любой двухцепочечной ДНК неспецифическое связывание может привести к избыточному количественному определению продукта ПЦР.
Рисунок 01: Техника SYBR Green
Что такое Такман?
Taqman - это альтернативный метод SYBR Green для мониторинга процесса ПЦР в реальном времени. Этот метод зависит от 5'-3'-экзонуклеазной активности фермента полимеразы Taq для деградации зондов во время удлинения новой цепи и высвобождения флуорофора. В этом методе используются зонды с двойной меткой, и он основан на гидролизе зондов. Зонды представляют собой флуоресцентно меченные олигонуклеотиды ДНК, содержащие флуоресцентную репортерную молекулу (флуорофор) на 5'-конце и молекулу-гаситель на 3'-конце. Они предназначены для связывания с одноцепочечной матрицей на противоположной стороне отжига праймера. Taq-полимераза добавляет нуклеотиды к праймеру и удлиняет новую цепь по направлению к зондам с двойной меткой. Как только Taq-полимераза встречается с зондом, экзонуклеазное действие Taq-полимеразы активирует и разрушает зонд. После завершения синтеза новой цепи зонд подвергается полной деградации и высвобождению флуорофора. Высвобождение флуорофора вызывает флуоресценцию. Молекула флуоресцентного гасителя эффективно гасит излучаемый свет и создает выходные данные для количественного определения продукта ПЦР. Высвобождение флуорофоров и количество продуктов ПЦР пропорциональны. Следовательно, количественная оценка может быть легко выполнена методом Такмана.
Рисунок 02: Метод Такмана
Метод Такмана используется в ПЦР в реальном времени, количественной оценке экспрессии генов, обнаружении генетических полиморфизмов, количественной оценке делеций хромосомной ДНК, идентификации бактерий, проверке микрочипового анализа, генотипировании SNP и т. д.
В чем разница между SYBR green и Taqman?
SYBR Green против Такмана |
|
| SYBR Green основан на ДНК-связывающем красителе. | Taqman зависит от гибридизационных зондов и экзонуклеазной активности Taq-полимеразы от 5’ до 3’. |
| Датчики с флуоресцентной маркировкой | |
| Флуоресцентные зонды не требуются. | Требуются датчики с двойной маркировкой. |
| Мультиплексный анализ генов | |
| Его нельзя использовать для мультиплексных генных мишеней. | Его можно использовать для множественных генов-мишеней. |
| Стоимость | |
| Это дешевле. | Это дороже. |
| Специфика | |
| Он менее специфичен и связывается с любой двухцепочечной ДНК | Они очень специфичны, поскольку зонды обнаруживают специфические продукты амплификации. |
| Эффективность | |
| Это менее эффективно. | Это очень эффективно. |
| Приложение | |
| Это используется в ПЦР в реальном времени, визуализации в агарозном геле, мечении ДНК и т.д. | Это используется в ПЦР в реальном времени, количественной оценке экспрессии генов, обнаружении генетических полиморфизмов и т.д. |
Резюме – SYBR Green и Taqman
Taqman и SYBR green - два метода, применяемые в ПЦР в реальном времени (количественная ПЦР). Оба метода обеспечивают эффективное количественное определение продукта ПЦР и основаны на испускании флуоресценции. В методе Taqman используются зонды с двойной меткой для обнаружения накопленной ДНК, в то время как в методе SYBR Green используется флуоресцентный краситель. Оба эти метода также имеют различные приложения в молекулярной биологии.
