Ключевая разница - северный, южный и вестерн-блоттинг
Обнаружение определенных последовательностей ДНК, РНК и белков имеет важное значение для различных типов исследований в области молекулярной биологии. Гель-электрофорез - это метод разделения ДНК, РНК и белков в соответствии с их размерами. Из профилей геля определяют конкретную последовательность ДНК, последовательность РНК или белок с помощью специальных методов, называемых блоттингом и гибридизацией с мечеными зондами. Существует три различных метода блоттинга, а именно южный, северный и вестерн. Ключевое различие между северным южным и вестерн-блоттингом заключается в типе молекулы, которую он обнаруживает в образце. Саузерн-блоттинг - это метод, который обнаруживает определенную последовательность ДНК в образце ДНК. Нозерн-блоттинг - это метод, который обнаруживает специфическую последовательность РНК из образца РНК. Вестерн-блоттинг - это метод, который обнаруживает определенный белок в образце белка.
Что такое саузерн-блоттинг?
Саузерн-блоттинг был разработан Э. М. Саузерн в 1975 году для идентификации определенной последовательности ДНК из образца ДНК. Это первый метод блоттинга, представленный в молекулярной биологии. Это позволило обнаружить определенные гены из ДНК, определенные фрагменты из ДНК и т. Д. Метод Саузерн-блоттинга включает несколько этапов. Они следующие.
- ДНК выделяют из образца и расщепляют эндонуклеазами рестрикции.
- Переваренный образец разделяется электрофорезом в агарозном геле.
- Фрагменты ДНК в геле денатурированы в отдельные нити с помощью щелочного раствора.
- Одноцепочечная ДНК переносится на нитроцеллюлозную фильтрующую мембрану методом капиллярного переноса.
- Перенесенная ДНК постоянно фиксируется на мембране.
- Фиксированная ДНК на мембране гибридизуется с мечеными зондами.
- Несвязанная ДНК смывается с мембраны промывкой.
- Рентгеновская пленка экспонируется на мембрану и готовится авторадиограмма.
Саузерн-блоттинг применяется для различных аспектов молекулярной биологии. Он полезен при картировании RFLP, криминалистических исследованиях, метилировании ДНК при экспрессии генов, обнаружении мутировавших генов при генетических нарушениях, снятии отпечатков пальцев ДНК и т. д.
Рисунок 01: Саузерн-блоттинг
Что такое нозерн-блоттинг?
Нозерн-блоттинг - это метод, предназначенный для обнаружения определенной последовательности РНК или последовательности мРНК в образце для изучения экспрессии генов. Этот метод был разработан Алвином, Кемпом и Старком в 1979 году. Он отличается от методов саузерн- и вестерн-блоттинга несколькими этапами. Однако этот метод также выполняется с помощью гель-электрофореза, блоттинга и гибридизации со специфическими мечеными зондами и детекции. Техника нозерн-блоттинга выполняется следующим образом.
- РНК выделяют из образца и разделяют с помощью гель-электрофореза.
- РНК переносится из геля на промокательную мембрану и фиксируется.
- Мембрану обрабатывают меченым зондом, приготовленным из кДНК или РНК (зонд комплементарен определенной последовательности в образце).
- Зонд инкубируют с мембраной для связывания с определенной последовательностью.
- Несвязанные зонды смываются.
- Гибридные фрагменты обнаруживаются с помощью авторадиографа.
Нозерн-блоттинг является важным инструментом для обнаружения и количественного определения гибридизованной мРНК, изучения деградации РНК, оценки периода полужизни РНК, обнаружения сплайсинга РНК, изучения экспрессии генов и т. д.
Рисунок 02: Нозерн-блоттинг
Что такое вестерн-блоттинг?
Вестерн-блоттинг - это метод обнаружения специфического белка в белковой смеси с использованием меченых антител. Поэтому вестерн-блот также известен как иммуноблот. Этот метод был представлен Таубином и др. в 1979 году, и в настоящее время он регулярно применяется в лабораториях для анализа белков. Шаги следующие.
- Из образца выделяются белки
- Белки разделяют по размеру с помощью электрофореза в полиакриламидном геле
- Отделенные молекулы переносятся на мембрану из ПВДФ или нитроцеллюлозу методом электропорации
- Мембрана блокируется для неспецифического связывания с антителами
- Переносимые белки связываются с первичными антителами (антитела, меченные ферментом).
- Мембрану промывают для удаления неспецифически связанных первичных антител
- Связанные антитела выявляют путем добавления субстрата и обнаружения образовавшегося окрашенного осадка
Вестерн-блоттинг полезен для обнаружения анти-ВИЧ-антител в образце сыворотки человека. Вестерн-блот также можно использовать в качестве подтверждающего теста на инфекцию гепатита В и окончательного теста на коровье бешенство.
Рисунок 03. Вестерн-блоттинг
В чем разница между нозерн-южным и вестерн-блоттингом?
Северный, Южный и Вестерн-блоттинг |
|
| Тип обнаруженной молекулы | |
| Нортерн Блоттинг | Нозерн-блоттинг обнаруживает определенную последовательность РНК в образце РНК. |
| Южный блоттинг | Саузерн-блоттинг позволяет обнаружить определенную последовательность ДНК в образце ДНК. |
| Вестерн-блоттинг | Вестерн-блоттинг позволяет обнаружить определенный белок в образце белка. |
| Тип геля | |
| Нортерн Блоттинг | При этом используется гель агарозы/формальдегида. |
| Южный блоттинг | При этом используется гель агарозы. |
| Вестерн-блоттинг | При этом используется полиакриламидный гель. |
| Метод блоттинга | |
| Нортерн Блоттинг | Это капиллярный перенос. |
| Южный блоттинг | Это капиллярный перенос. |
| Вестерн-блоттинг | Это электрическая передача. |
| Используемые датчики | |
| Нортерн Блоттинг | зонды кДНК или РНК, меченные радиоактивно или нерадиоактивно. |
| Южный блоттинг | ДНК-зонды маркируются радиоактивно или нерадиоактивно. |
| Вестерн-блоттинг | В качестве зондов используются первичные антитела. |
| Система обнаружения | |
| Нортерн Блоттинг | Это делается с помощью авторадиографа или обнаружения изменения света или цвета. |
| Южный блоттинг | Это делается с помощью авторадиографии, обнаружения изменения света или цвета. |
| Вестерн-блоттинг | Это делается с помощью обнаружения изменения света или цвета. |
Резюме – Северный, Южный и Вестерн-блоттинг
Блоттинг - это специальная методика, разработанная для идентификации специфической ДНК, РНК или белка в образцах. Существует три отдельных процедуры блоттинга, а именно северный, южный и вестерн, для обнаружения определенного типа молекулы. Техника Нозерн-блоттинга предназначена для обнаружения определенной последовательности РНК из смеси РНК. Метод Саузерн-блоттинга позволяет обнаруживать определенную последовательность ДНК в образце ДНК, а метод вестерн-блоттинга разработан для идентификации определенного белка из белковой смеси.
