Ключевая разница - ОТ-ПЦР и КПЦР
Полимеразная цепная реакция - это метод, используемый для амплификации определенного участка ДНК in vitro. Благодаря изобретению этого метода Кэри Маллисом в 1983 году ученые могут создавать от тысяч до миллионов копий определенных фрагментов ДНК для исследовательских целей. В настоящее время это стало обычным и рутинным методом в клинических и исследовательских лабораториях для широкого спектра применений. Существуют варианты традиционной техники ПЦР, такие как ОТ-ПЦР, вложенная ПЦР, мультиплексная ПЦР, Q-ПЦР, ОТ-КПЦР и т. д. ОТ-ПЦР и Q-ПЦР являются двумя важными вариантами ПЦР. Основное различие между ОТ-ПЦР и Q-ПЦР заключается в том, что ОТ-ПЦР используется для обнаружения экспрессии генов путем создания транскриптов комплементарной ДНК (кДНК) из РНК, тогда как Q-ПЦР используется для количественного измерения продуктов ПЦР в реальном времени с использованием флуоресцентных красителей.
Что такое ОТ-ПЦР?
Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) представляет собой вариант ПЦР, который используется для обнаружения экспрессии РНК. Это очень важный метод обнаружения экспрессии мРНК в тканях. ОТ-ПЦР используется, когда исходным материалом образца является РНК. В ОТ-ПЦР матричная мРНК сначала превращается в комплементарную ДНК. Этот этап катализируется ферментом обратной транскриптазой, и этот процесс известен как обратная транскрипция. Во-вторых, для амплификации вновь синтезированной кДНК используется традиционная ПЦР.
ПЦР в реальном времени является высокочувствительным методом, для которого требуется относительно небольшое количество образца РНК. ОТ-ПЦР обычно используется для диагностики и количественного определения видов РНК, особенно РНК-вирусов, таких как вирус иммунодефицита человека и вирус гепатита С.
Рисунок 01: Метод ОТ-ПЦР
Что такое QPCR?
Количественная ПЦР (КПЦР) - это вариант ПЦР, который используется для количественного измерения продуктов ПЦР. Его также называют полимеразной цепной реакцией в реальном времени, поскольку он измеряет амплификацию в реальном времени с использованием машины для ПЦР в реальном времени. Это подходящий метод для определения количества целевой последовательности или гена, присутствующего в образце. Интересной особенностью КПЦР является то, что она объединяет как амплификацию, так и истинную количественную оценку в один шаг. Поэтому необходимость в гель-электрофорезе для обнаружения может быть устранена с помощью метода КПЦР. QPCR использует флуоресцентные красители для маркировки продуктов PCR во время реакций PCR, которые в конечном итоге приводят к прямому количественному определению. Когда продукты ПЦР накапливаются, флуоресцентные сигналы также накапливаются, и это будет измеряться машиной реального времени. КПЦР можно сочетать с ОТ-ПЦР. Он известен как RT-QPCR или QRT-PCR и считается наиболее мощным, чувствительным и количественным методом определения уровней РНК в клетках или тканях.
SYBR Green и Taqman - это два метода, используемые для обнаружения или наблюдения за процессом амплификации ПЦР в реальном времени. Метод SYBR Green проводится с использованием флуоресцентного красителя под названием SYBR green и обнаруживает амплификацию путем связывания красителя с образованием двухцепочечной ДНК. Taqman проводится с использованием зондов с двойной меткой и обнаруживает амплификацию путем деградации зонда Taq-полимеразой и высвобождения флуорофора, как показано на рисунке 02. Оба метода отслеживают ход процесса амплификации и сообщают о количестве продукта в режиме реального времени..
ПЦР в реальном времени имеет широкий спектр применений, таких как количественная оценка экспрессии генов, анализ микроРНК и некодирующих РНК, генотипирование SNP, обнаружение вариантов числа копий, обнаружение редких мутаций, обнаружение генетически модифицированных организмов, обнаружение инфекционных агентов и т.д.
Рисунок 02: Метод количественной ПЦР
В чем разница между ОТ-ПЦР и КПЦР?
ПЦР в реальном времени и КПЦР |
|
| ПЦР в реальном времени - это метод, используемый для обнаружения экспрессии генов путем амплификации. | QPCR - это метод, который амплифицирует ДНК и количественно определяет продукты ПЦР в режиме реального времени. |
| Вовлечение фермента обратной транскриптазы | |
| Ферментная обратная транскриптаза используется для ОТ-ПЦР. | Ферментная обратная транскриптаза не используется для количественной ПЦР. |
| Использование флуоресцентно меченых молекул | |
| Флуоресцентно меченные красители или зонды не используются для ОТ-ПЦР. | Для КПЦР используются флуоресцентно меченные красители или зонды. |
| Количественное определение продукта ПЦР | |
| Если не используется КПЦР, ОТ-ПЦР не дает количественного определения продукта ПЦР. | КПЦР количественно измеряет продукт ПЦР. |
| Исходный материал | |
| Исходным материалом является мРНК. | Исходным материалом является ДНК. |
| Синтез кДНК | |
| Комплементарная ДНК образуется во время ОТ-ПЦР. | Комплементарная ДНК не образуется во время количественной ПЦР. |
Резюме – ОТ-ПЦР и КПЦР
RT PCR и QPCR - это две версии традиционной PCR. Техника ОТ-ПЦР выполняется для образцов мРНК и основана на обратной транскрипции и производстве кДНК. КПЦР используется для количественного определения продуктов ПЦР во время термоциклов ПЦР в реальном времени с использованием флуоресцентных красителей или меченых зондов. В КПЦР количество продукта ПЦР представлено испускаемыми образцом флуоресцентными сигналами. ОТ-ПЦР обычно используется в качестве процесса амплификации, тогда как КПЦР обычно используется в качестве процесса количественного определения. В этом разница между ОТ-ПЦР и КПЦР.
