Ключевое различие между Golden Gate и Gibson Assembly заключается в том, что Golden Gate полагается на наличие сайтов рестрикции в определенной последовательности, подлежащей клонированию, тогда как Gibson Assembly не полагается на наличие сайтов рестрикции в конкретной последовательности для клонирования. быть клонированным.
За последние десятилетия ученые-молекулы разработали различные стандартизированные процедуры, упрощающие сборку нескольких фрагментов ДНК в единый фрагмент. Поэтому методы клонирования, такие как лигирование рестрикционных ферментов, клонирование шлюза, сборка Гибсона, сборка золотых ворот и клонирование TOPO, широко используются исследователями в научных экспериментах. Таким образом, Golden Gate и Gibson Assembly - это два метода молекулярного клонирования, которые позволяют собирать несколько фрагментов ДНК в единый фрагмент.
Что такое Golden Gate Assembly?
Golden Gate - это метод молекулярного клонирования, который упрощает сборку нескольких фрагментов ДНК в единый фрагмент. Этот метод основан на наличии сайтов рестрикции в конкретной клонируемой последовательности. Он возник в 1996 году. В этом методе используются рестрикционные ферменты типа IIS и ДНК-лигаза T4. Эти ферменты разрезают ДНК вне мест узнавания. Они могут создавать непалиндромные выступы. Следовательно, можно собрать несколько фрагментов ДНК, используя комбинации выступающих последовательностей.
Рисунок 01: Золотые ворота
Процедура сборки Golden Gate
Техника Золотых Ворот состоит из трех основных этапов:
- создание выступов в векторе клонирования,
- сборка нескольких ДНК-вставок с использованием специфичных для фрагментов последовательностей в выступающих частях и
- перевязка.
Сборка Golden Gate использует вектора циклического клонирования (вектор назначения). Кроме того, в этом методе сайт рестрикции удаляется из лигированного продукта для одновременного проведения расщепления и лигирования. Типичный протокол температурного цикла для Golden Gate колеблется между 37 °C и 16 °C, поскольку 37 °C оптимальна для ферментов рестрикции, а 16 °C оптимальна для лигаз.
Что такое Gibson Assembly?
Gibson Assembly - это метод молекулярного клонирования, который позволяет собирать несколько фрагментов ДНК в единый фрагмент. В отличие от метода «Золотые ворота», этот метод не зависит от наличия сайтов рестрикции в конкретной клонируемой последовательности. Он был найден Дэниелом Г. Гибсоном из Института Дж. Крейга Вентера. Этот метод представляет собой тип метода независимого клонирования последовательности и лигазы (SLIC).
Рисунок 02: Сборка Gibson
Процедура сборки Gibson
Gibson Assembly нужны фрагменты ДНК, содержащие 20-40 пар оснований, перекрывающиеся с соседними фрагментами ДНК. Перекрытия добавляются с помощью ПЦР. Затем эти фрагменты ДНК добавляют к мазерной смеси Гибсона, содержащей три фермента. Эту процедуру проводят в изотермических условиях (50°С в течение 1 часа) с использованием трех различных ферментов: экзонуклеазы, ДНК-полимеразы и ДНК-лигазы. Экзонуклеаза отгрызает ДНК с 5’-конца. Таким образом, он не ингибирует активность полимеразы и позволяет реакции протекать в одном единственном процессе. Полученные одноцепочечные участки на соседних фрагментах ДНК могут отжигаться за счет перекрывания последовательностей. ДНК-полимераза заполняет пробелы, добавляя нуклеотиды. Наконец, ДНК-лигаза ковалентно соединяет ДНК соседних сегментов. Обычно Gibson Assembly использует линеаризованные векторы назначения. Более того, этот метод может одновременно объединять до 15 фрагментов ДНК на основе сходства последовательностей.
Сходства между Golden Gate и Gibson Assembly
- Golden Gate и Gibson Assembly - два метода молекулярного клонирования.
- Оба метода позволяют собрать несколько фрагментов ДНК в один фрагмент.
- Эти методы используют векторы назначения.
- В обоих методах используются термоциклеры для сборки нескольких фрагментов ДНК.
- Они используются в сайт-направленном мутагенезе.
Разница между Golden Gate и Gibson Assembly
Golden Gate - это метод молекулярного клонирования, используемый для сборки нескольких фрагментов ДНК в единый фрагмент, основанный на наличии сайтов рестрикции в конкретной клонируемой последовательности, в то время как Gibson Assembly - это метод молекулярного клонирования, используемый в сборка нескольких фрагментов ДНК в единый фрагмент, не полагаясь на наличие сайтов рестрикции в конкретной клонируемой последовательности. В этом ключевое отличие Golden Gate от Gibson Assembly. Кроме того, в методе Golden Gate используется круговой вектор назначения, а в методе Gibson Assembly используется линеаризованный вектор назначения.
Следующая инфографика показывает разницу между Golden Gate и Gibson Assembly.
Резюме – Golden Gate против Gibson Assembly
Молекулярное клонирование - это метод, используемый для сборки рекомбинантных молекул ДНК и направления их репликации в организмах-хозяевах. Golden Gate и Gibson Assembly - это два метода молекулярного клонирования, которые позволяют собирать несколько фрагментов ДНК в единый фрагмент. Метод Golden Gate основан на наличии сайтов рестрикции в конкретной клонируемой последовательности, в то время как Gibson Assembly не полагается на наличие сайтов рестрикции в конкретной клонируемой последовательности. Таким образом, в этом ключевое отличие Golden Gate от Gibson Assembly.
