Ключевая разница – праймеры для ПЦР и праймеры для секвенирования
С последними достижениями в области молекулярной биологии были разработаны различные генетические методы, которые сделали процессы исследования различных аспектов предмета простыми и точными. ПЦР и другие процедуры секвенирования являются двумя важными такими методами. Они используют разные подкомпоненты. Праймеры считаются основным подкомпонентом, общим как для методов ПЦР, так и для методов секвенирования. Праймеры для ПЦР используются для амплификации определенной последовательности ДНК, в то время как праймеры для секвенирования используются в контексте секвенирования фрагмента ДНК с целью выявления его конкретного порядка нуклеотидной последовательности. В этом ключевое различие между праймерами для ПЦР и праймерами для секвенирования.
Что такое праймеры для ПЦР?
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это генетический метод, который используется в области молекулярной биологии для амплификации одной или нескольких копий определенного сегмента ДНК и получения многих миллионов идентичных копий. В реакции ПЦР используются различные компоненты, включая праймеры. Праймеры представляют собой короткие нити ДНК длиной 18-25 нуклеотидов, что делает их совместимыми с начальной и конечной областями амплифицируемых фрагментов ДНК. Праймеры могут быть прямыми и обратными. Эти праймеры связываются с фрагментом ДНК в определенных точках, где ДНК-полимераза связывается с конкретным праймером в этом месте и инициирует синтез новой цепи ДНК.
Подбор праймеров является важным аспектом процесса ПЦР. Большое значение имеет выбор длины праймера. Идеальная длина должна быть 18-25 нуклеотидов. Если длина слишком короткая или слишком длинная, праймеры не будут связываться с последовательностью ДНК для точной амплификации. Слишком короткие праймеры приводят к неспецифическому отжигу праймеров в разных местах последовательности ДНК.
Рисунок 01: Праймеры для ПЦР
Содержание гуанина и цитозина (GC) в хорошем праймере должно быть в пределах 40-60. Температура отжига праймера и температура плавления являются жизненно важными факторами во время ПЦР. Температура плавления должна быть рассчитана точно, а температура отжига грунтовки должна быть на 5°C ниже температуры плавления. Температура плавления должна быть 60°C и 75°C. Слишком высокие или слишком низкие температуры приведут к снижению активности ДНК-полимеразы.
Что такое праймеры для секвенирования?
Праймеры для секвенирования используются в контексте секвенирования фрагмента ДНК с целью выявления его специфической идентичности. Для получения хороших результатов секвенирования важны высококачественные праймеры и матрицы. Таким образом, когда выбираются праймеры, они должны быть уникальными для конкретной области, которую мы хотим секвенировать. Он также должен быть с правильной ориентацией, когда последовательности обычно генерируются от 3’- до 5’-концов праймеров. В последовательности не должно быть нежелательной самогибридизации, такой как образование петель шпильки. Он не должен содержать последовательного образования гуаниновых оснований.
Температура плавления (Tm) праймера должна соответствовать условиям секвенирования. Следовательно, она должна лежать между 52oC и 74oC. Препарат олигонуклеотидов для использования в качестве праймера должен быть очищен для получения желаемой полноразмерной последовательности. Если олигонуклеотиды содержат примеси, сигнальные последовательности праймеров будут накладываться друг на друга из разных сайтов праймирования, что также приведет к уменьшению количества базовых клеток.
Рисунок 02: Праймеры для секвенирования
Температура плавления праймера (Tm) олигонуклеотида определяет, насколько сильно комплементарные нити ДНК гибридизуются друг с другом. Tm можно рассматривать как термодинамический расчет, где он зависит как от последовательностей ДНК, так и от нескольких условий, таких как концентрация соли. Tm важен во время ПЦР, где используется вариант, называемый циклическим секвенированием, для получения группы фрагментов, оканчивающихся дидезоксинуклеотидами. Здесь секвенированный праймер сначала альтернативно отжигают, затем удлиняют и, наконец, денатурируют для амплификации. Таким образом, значение Tm должно быть между 52oC и 74o C. Синтезированные олигонуклеотиды можно получить в лабораториях синтеза ДНК/РНК согласно выбор. Малый масштаб синтеза, который используется для секвенирования ДНК, обычно составляет 50 нмоль. Также, что наиболее важно, праймеры, используемые для секвенирования, должны быть очищены от примесей, которые предотвратят снижение качества.
Каковы сходства между праймерами для ПЦР и праймерами для секвенирования?
- И праймеры для ПЦР, и праймеры для секвенирования представляют собой праймеры, которые используются в процессе амплификации целевой последовательности ДНК.
- И праймеры для ПЦР, и праймеры для секвенирования состоят из нуклеотидов.
- И праймеры для ПЦР, и праймеры для секвенирования представляют собой короткие олигомеры.
В чем разница между праймерами для ПЦР и праймерами для секвенирования?
Праймеры для ПЦР и праймеры для секвенирования |
|
| ПЦР-праймеры представляют собой короткие нити ДНК с длиной нуклеотидной последовательности 18-25, что делает их совместимыми с начальной и конечной областью фрагментов ДНК, подлежащих амплификации. | Праймеры для секвенирования представляют собой короткие олигомеры, которые используются в контексте секвенирования фрагмента ДНК с целью выявления его специфической идентичности. |
| Функция | |
| ПЦР-праймеры используются для амплификации определенной последовательности ДНК. | Праймеры для секвенирования используются в контексте секвенирования фрагмента ДНК с целью выявления его специфической идентичности. |
| Необходимое количество праймеров | |
| Два праймера; один прямой праймер и один обратный праймер используются в качестве праймеров для ПЦР. | Требуется только один праймер для секвенирования. |
Резюме – Праймеры для ПЦР и праймеры для секвенирования
Праймеры для секвенирования используются в контексте секвенирования фрагмента ДНК с целью выявления его специфической идентичности. Одного праймера для секвенирования будет достаточно для запуска процесса. Для получения хороших результатов секвенирования важны высококачественные праймеры и матрицы. Таким образом, когда выбираются праймеры, они должны быть уникальными для конкретной области, которую мы хотим секвенировать. Праймеры для ПЦР представляют собой короткие нити ДНК длиной 18-25 нуклеотидов, совместимые с начальной и конечной областью фрагментов ДНК, подлежащих амплификации. Праймеры для ПЦР могут быть прямыми и обратными. Содержание гуанина и цитозина (GC) в хорошем праймере должно быть в пределах 40-60. Температура отжига праймера и температура плавления являются жизненно важными аспектами во время ПЦР. В этом разница между праймерами для ПЦР и праймерами для секвенирования.
