Ключевая разница – ПЦР и секвенирование ДНК
ПЦР и секвенирование ДНК - два важных метода в молекулярной биологии. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это процесс, при котором создается большое количество копий фрагмента ДНК. Секвенирование ДНК - это метод, который приводит к точному порядку нуклеотидов данного фрагмента ДНК. В этом ключевое различие между ПЦР и секвенированием ДНК. ПЦР является одним из основных этапов секвенирования ДНК.
Что такое ПЦР?
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это метод амплификации ДНК, используемый в молекулярной биологии. Он производит от тысяч до миллионов копий определенного фрагмента ДНК. Этот метод был разработан Кэри Маллисом в 1983 году. В этом методе фрагмент ДНК, подлежащий амплификации, служит матрицей, а фермент ДНК-полимераза добавляет комплементарные нуклеотиды к праймеру, который имеется в смеси для ПЦР. В конце реакции ПЦР синтезируется множество копий ДНК образца.
Существуют различные компоненты смеси для ПЦР, включая ДНК, ДНК-полимеразу (Taq-полимеразу), праймеры (прямой и обратный праймеры), нуклеотиды (строительные блоки ДНК) и буфер. ПЦР происходит внутри машины для ПЦР, и в машину должна быть загружена правильная смесь для ПЦР, и должна быть запущена правильная программа. Этот метод позволяет производить от тысяч до миллионов копий определенного участка ДНК из очень небольшого количества ДНК.
Реакции ПЦР протекают циклически с образованием видимого количества продуктов ПЦР на геле. Реакция ПЦР включает три основных этапа, а именно денатурацию, отжиг праймеров и удлинение цепи, как показано на рисунке 01. Эти три стадии происходят при трех разных температурах. ДНК существует в двухцепочечной форме за счет водородных связей между комплементарными основаниями. Перед импликацией двухцепочечные ДНК должны быть отделены друг от друга. Это делается путем подачи высокой температуры. При высокой температуре двухцепочечная ДНК денатурирует до одноцепочечной. Затем праймеры должны подойти ближе к фланкирующим концам конкретного фрагмента или гена ДНК. Праймер представляет собой короткий фрагмент одноцепочечной ДНК, комплементарный целевой последовательности. Прямые и обратные праймеры отжигают с комплементарными основаниями на фланкирующих концах ДНК денатурированного образца при температуре отжига. Грунтовка должна быть термостойкой. После отжига праймеров с образцом ДНК фермент taq-полимераза инициирует синтез новых цепей путем добавления нуклеотидов, комплементарных ДНК-мишени. Taq-полимераза представляет собой термостабильный фермент, выделенный из термофильной бактерии под названием Thermus aquaticus. Буфер для ПЦР поддерживает оптимальные условия для действия taq-полимеразы. Эти три стадии реакции ПЦР повторяются для получения необходимого количества продукта ПЦР. После каждой реакции ПЦР количество копий ДНК удваивается. Следовательно, в ПЦР можно наблюдать экспоненциальную амплификацию. Продукты ПЦР можно наблюдать с помощью гель-электрофореза и очищать для дальнейших исследований.
Рисунок 01: Основные этапы реакции ПЦР
ПЦР является ценным инструментом в медицинских и биологических исследованиях. ПЦР имеет особое значение в криминалистике, поскольку она может амплифицировать ДНК для исследований из крошечных образцов преступников и составлять криминалистические профили ДНК. ПЦР широко используется во многих областях молекулярной биологии, включая генотипирование, клонирование генов, обнаружение мутаций, секвенирование ДНК, ДНК-микрочипы, тестирование на отцовство и т. д.
Рисунок 02: Полимеразная цепная реакция
Что такое секвенирование ДНК?
Секвенирование ДНК – это определение точного порядка расположения нуклеотидов – аденина, гуанина, цитозина и тимина в данном фрагменте ДНК. Генетическая информация хранится в последовательностях ДНК с использованием правильного порядка нуклеотидов. Следовательно, определение точного порядка нуклеотидов во фрагменте ДНК очень важно для понимания структуры и функции генов.
Протокол секвенирования ДНК включает различные процессы. Первым шагом является выделение интересующей ДНК или геномной ДНК организма. С помощью ПЦР (как описано выше) нужно амплифицировать нужный участок ДНК. Амплифицированный продукт ПЦР необходимо разделить с помощью гель-электрофореза и очистить. Амплифицированные фрагменты служат шаблонами для секвенирования. Секвенирование можно проводить либо в соответствии с секвенированием по Сэнгеру, либо методом высокопроизводительного секвенирования. Секвенирование по Сэнгеру требует капиллярного электрофореза полученных фрагментов ДНК. Определение правильного порядка нуклеотидов можно выполнить путем ручного считывания авторадиограмм или с помощью автоматических секвенаторов ДНК.
Секвенирование генов внесло свой вклад в проект «Геном человека» и облегчило картирование генома человека в 2003 году. В криминалистике секвенирование ДНК позволило идентифицировать людей, которые демонстрируют уникальные последовательности ДНК, и идентифицировать преступников. В медицине секвенирование ДНК можно использовать для обнаружения генов, ответственных за генетические и другие заболевания, поиска дефектных генов и замены их правильными генами. В сельском хозяйстве информация о секвенировании ДНК некоторых микроорганизмов используется для получения трансгенных культур с экономически желаемыми характеристиками.
Рисунок 03. Секвенирование ДНК
В чем разница между ПЦР и секвенированием ДНК?
ПЦР против секвенирования ДНК |
|
| Процесс ПЦР создает от тысяч до миллионов копий интересующего фрагмента ДНК. | Секвенирование ДНК - это процесс определения точного порядка нуклеотидов в заданном фрагменте ДНК. |
| Результат | |
| ПЦР создает от тысяч до миллионов копий определенного фрагмента ДНК | Это приводит к правильному порядку оснований в определенном фрагменте ДНК. |
| Участие ddNTP | |
| ПЦР не требует ddNTP. Он использует dNTP. | Секвенирование ДНК требует, чтобы ddNTP прекратили формирование цепи. |
Резюме – ПЦР и секвенирование ДНК
ПЦР и секвенирование ДНК являются очень важными инструментами во многих областях молекулярной биологии. Амплификация фрагментов ДНК осуществляется методом ПЦР, а правильный порядок нуклеотидов фрагмента ДНК определяется секвенированием ДНК. В этом разница между ПЦР и секвенированием ДНК.
