Ключевая разница - микрочип против секвенирования РНК
Транскриптом представляет собой все содержание РНК, присутствующей в клетке, включая мРНК, рРНК, тРНК, деградированную РНК и недеградированную РНК. Профилирование транскриптома является важным процессом для понимания клеточных идей. Существует несколько продвинутых методов профилирования транскриптома. Микрочипы и секвенирование РНК - это два типа технологий, разработанных для анализа транскриптома. Основное различие между микрочипом и секвенированием РНК заключается в том, что микрочип основан на потенциале гибридизации предварительно сконструированных меченых зондов с целевыми последовательностями кДНК, в то время как секвенирование РНК основано на прямом секвенировании цепей кДНК с помощью передовых методов секвенирования, таких как NGS. Микрочип выполняется с предварительными знаниями о последовательностях, а секвенирование РНК выполняется без предварительных знаний о последовательностях.
Что такое микрочип?
Microarray - это надежный, надежный и высокопроизводительный метод, используемый учеными для профилирования транскриптома. Это самый популярный подход к анализу транскриптов. Это недорогой метод, который зависит от зондов для гибридизации.
Техника начинается с выделения мРНК из образца и создания библиотеки кДНК из тотальной РНК. Затем его смешивают с предварительно нанесенными флуоресцентно мечеными зондами на твердую поверхность (точечный матрикс). Дополнительные последовательности гибридизуются с мечеными зондами в микрочипе. Затем микроматрицу промывают и просеивают, а изображение оценивают количественно. Собранные данные необходимо проанализировать, чтобы получить относительные профили экспрессии.
Предполагается, что интенсивность зондов микрочипа пропорциональна количеству транскриптов в образце. Однако точность метода зависит от разработанных зондов, предварительного знания последовательности и сродства зондов к гибридизации. Следовательно, технология микрочипов имеет ограничения. Техника микрочипов не может быть выполнена с транскриптами с низким содержанием. Он не может дифференцировать изоформы и идентифицировать генетические варианты. Поскольку этот метод зависит от гибридизации зондов, некоторые проблемы, связанные с гибридизацией, такие как перекрестная гибридизация, неспецифическая гибридизация и т. д., возникают в методе микрочипов.
Рисунок 01: Микрочип
Что такое секвенирование РНК?
Секвенирование дробовика РНК (RNA seq) - это недавно разработанный метод секвенирования всего транскриптома. Это быстрый и высокопроизводительный метод профилирования транскриптома. Он напрямую определяет экспрессию генов и приводит к глубокому исследованию транскриптома. Последовательность РНК не зависит от предварительно разработанных зондов или предварительного знания последовательностей. Таким образом, метод секвенирования РНК обладает высокой чувствительностью и способностью обнаруживать новые гены и генетические варианты.
Метод секвенирования РНК выполняется в несколько этапов. Общая РНК клетки должна быть выделена и фрагментирована. Затем с помощью обратной транскриптазы необходимо подготовить библиотеку кДНК. Каждая цепь кДНК должна быть лигирована с адаптерами. Затем лигированные фрагменты необходимо амплифицировать и очистить. Наконец, используя метод NGS, необходимо выполнить секвенирование кДНК.
Рисунок 02: Секвенирование РНК
В чем разница между микрочипом и секвенированием РНК?
Микрочип против секвенирования РНК |
|
| Microarray - надежный, надежный метод с высокой пропускной способностью. | Секвенирование РНК является точным и высокопроизводительным методом. |
| Стоимость | |
| Это недорогой метод. | Это дорогой метод. |
| Анализ большого количества проб | |
| Это облегчает одновременный анализ большого количества образцов. | Это облегчает анализ большого количества образцов. |
| Анализ данных | |
| Анализ данных сложен. | В этом методе генерируется больше данных; следовательно, процесс более сложный. |
| Предварительное знание последовательностей | |
| Этот метод основан на гибридизации зондов, поэтому требуется предварительное знание последовательностей. | Этот метод не зависит от знания априорной последовательности. |
| Структурные вариации и новые гены | |
| Этот метод не может обнаружить структурные вариации и новые гены. | Этот метод может обнаруживать структурные вариации, такие как слияние генов, альтернативный сплайсинг и новые гены. |
| Чувствительность | |
| Этот метод не может обнаружить различия в экспрессии изоформ, поэтому его чувствительность ограничена. | Высокая чувствительность. |
| Результат | |
| Это может привести только к относительным уровням экспрессии. Это не дает абсолютной количественной оценки экспрессии генов. | Показывает абсолютные и относительные уровни экспрессии. |
| Повторный анализ данных | |
| Это необходимо повторить для повторного анализа. | Данные секвенирования могут быть повторно проанализированы. |
| Потребность в конкретном персонале и инфраструктуре | |
| Специальная инфраструктура и персонал не требуются для микрочипов. | Специальная инфраструктура и персонал, необходимые для секвенирования РНК. |
| Технические проблемы | |
| У метода микрочипов есть технические проблемы, такие как кросс-гибридизация, неспецифическая гибридизация, ограниченная скорость обнаружения отдельных зондов и т. д. | Техника секвенирования РНК позволяет избежать технических проблем, таких как кросс-гибридизация, неспецифическая гибридизация, ограниченная скорость обнаружения отдельных зондов и т. д. |
| Предубеждения | |
| Это необъективный метод, поскольку он зависит от гибридизации. | Смещение меньше по сравнению с микрочипом. |
Резюме – Микрочип против секвенирования РНК
Микрочипы и методы секвенирования РНК представляют собой высокопроизводительные платформы, разработанные для профилирования транскриптома. Оба метода дают результаты, которые сильно коррелируют с профилями экспрессии генов. Однако секвенирование РНК имеет преимущества перед микрочипами для анализа экспрессии генов. Секвенирование РНК является более чувствительным методом обнаружения транскриптов с низким содержанием, чем микрочип. Секвенирование РНК также позволяет различать изоформы и идентифицировать варианты генов. Тем не менее, большинство исследователей выбирают микрочипы, поскольку секвенирование РНК - это новый и дорогой метод, связанный с проблемами хранения данных и сложным анализом данных.
