Ключевая разница – теплая и холодная трипсинизация
Теплая и холодная трипсинизация - это два метода, используемые для ферментативной дезагрегации клеток при культивировании клеток животных. Ключевое различие между теплой и холодной трипсинизацией, как следует из названий, зависит от температуры, при которой трипсин добавляется для клеточной дезагрегации. Теплая трипсинизация происходит при более высоких температурах (36,5 – 37°C0C), тогда как холодная трипсинизация происходит при низких температурах.
В процессе первичного культивирования клеток животных используются три основных метода, доказавших свою эффективность. Эти три метода включают механическую дезагрегацию клеток, ферментативную дезагрегацию клеток и технику первичного эксплантата. Ферментативная дезагрегация клеток, приводящая к изоляции клеток, осуществляется ферментом трипсином, расщепляющим белок. Поэтому этот процесс известен как трипсинизация. Трипсинизацию можно проводить в двух разных условиях, а именно в теплой трипсинизации и в холодной трипсинизации. Теплая трипсинизация – это метод обработки клеток трипсином в теплых условиях при температуре 36,5 – 37°С. Холодная трипсинизация - это процесс обработки трипсином, происходящий в более холодных условиях, предпочтительно во льду, при очень низкой температуре.
Что такое теплая трипсинизация?
Трипсинизация может быть проведена для дезагрегации клеточных компонентов, чтобы изолировать клетки для получения первичной клеточной культуры. Трипсин является ферментом деградации белка, и смесь ферментов, используемая при трипсинизации, может быть либо сырым экстрактом, либо очищенным продуктом. Считается, что неочищенный экстракт более эффективен в лизисе белка и распаде клеток, так как он содержит другие ферменты, разрушающие ферменты.
Теплая трипсинизация является наиболее часто используемым ферментативным методом дезагрегации клеток, происходящим в условиях более высокой температуры. Перед обработкой трипсином желаемую ткань нарезают на более мелкие кусочки. Это облегчает процесс дезагрегации. Нарезанную ткань затем промывают в специальной среде, известной как среда Dissection Basal S alt.
По завершении этапа промывки клетки переносят в колбу, содержащую активный фермент – трипсин. Поскольку этот метод подразумевает протокол теплой трипсинизации, трипсин помещают при температуре около 37°C на четыре часа.
Рисунок 01: Трипсин
Содержимое смешивают и взбалтывают с использованием методов центрифугирования для простоты протокола и ускорения процесса дезагрегации. По истечении рекомендуемого времени клетки могут быть получены из супернатанта. Затем клетки, полученные из супернатанта, инкубируют при определенной температуре и времени.
Что такое холодная трипсинизация?
Холодная трипсинизация - это другой тип трипсинизации, происходящий в холодных условиях. В этом методе нарезанные и промытые клетки помещают во флаконы на лед, а затем пропитывают трипсином. Период замачивания гораздо дольше – около 6 – 24 часов.
После завершения процедуры замачивания трипсин удаляют из клеточного лизата, а кусочки ткани далее инкубируют при 37 0°C в течение примерно 20–30 минут. Дезагрегацию клеток вызывают повторным пипетированием тканевой смеси. Это позволит клеткам отделиться от мембраны и попасть в супернатант. Когда клетки находятся в супернатанте, их инкубируют и выращивают при желаемой температуре и периоде времени.
Метод холодной трипсинизации имеет ряд преимуществ
- Более высокий выход жизнеспособных клеток, так как повреждение клеток сведено к минимуму. Повреждение клеток сводится к минимуму за счет отказа от центрифугирования.
- Очень удобный способ.
- Менее трудоемкий.
Основным ограничением метода холодной трипсинизации является невозможность одновременного использования больших количеств.
Каковы сходства между теплой и холодной трипсинизацией?
- В процессах теплой и холодной трипсинизации используется фермент трипсин для дезагрегации клеток.
- В процессах культивирования клеток для дезагрегации клеток используются процессы как теплой, так и холодной трипсинизации.
- В процедурах теплой и холодной трипсинизации клетки получают из супернатанта.
В чем разница между теплой и холодной трипсинизацией?
Теплая и холодная трипсинизация |
|
| Теплая трипсинизация – метод обработки клеток трипсином в теплых условиях при температуре 36,5 – 37°С. | Холодная трипсинизация – это процесс обработки трипсином, происходящий в более холодных условиях, предпочтительно во льду, при очень низкой температуре. |
| Протокол | |
| Нарезанные кусочки ткани поддерживаются при температуре 37 0C непрерывно на протяжении всей процедуры. | Нарезанные кусочки ткани сначала выдерживают при ледяной температуре, а затем выдерживают при 37 0. |
| Температура | |
| Теплая трипсинизация происходит при 36,5 – 37 0 | Холодная трипсинизация происходит при ледяных температурах. |
| Потрачено времени | |
| Меньшее время требуется для всего процесса (около 4 часов) теплой трипсинизации. | Для холодной трипсинизации требуется больше времени (около 6-24 часов). |
| Выход жизнеспособных клеток | |
| Низкое содержание трипсина в тепле. | Высокая холодовая трипсинизация. |
| Использование центрифугирования | |
| Центрифугирование требуется для дезагрегации клеток при теплой трипсинизации. | Центрифугирование не требуется при холодной трипсинизации. |
| Исходное количество ткани для трипсинизации | |
| Для теплой трипсинизации можно использовать большее количество ткани. | Меньшее количество ткани может быть использовано для холодной трипсинизации. |
| Повреждение клеток | |
| Высокий из-за центрифугирования при теплой трипсинизации. | Меньше из-за холодной трипсинизации. |
Резюме – Теплая и холодная трипсинизация
Трипсинизация - это метод использования расщепляющего белки фермента трипсина для дезагрегации и приготовления первичных клеточных культур в процессе культивирования клеток. Существует два основных метода трипсинизации, основанных на температурах, используемых во время процедуры. Различают теплую и холодную трипсинизацию. Теплую трипсинизацию проводят при 37°С, тогда как холодную трипсинизацию проводят в условиях охлаждения льдом. Хотя холодная трипсинизация занимает больше времени для завершения, считается, что она дает более высокий выход жизнеспособных клеток. Это связано с тем, что повреждение клеток при холодной трипсинизации сводится к минимуму, поскольку при этом не используются этапы энергичного центрифугирования. В этом разница между теплой и холодной трипсинизацией.
