Ключевая разница - клонирование генов и ПЦР
Синтез множества копий ДНК из определенного фрагмента ДНК называется амплификация ДНК. Существует два основных процесса амплификации ДНК, а именно клонирование генов и ПЦР. Ключевое различие между клонированием гена и ПЦР заключается в том, что клонирование гена создает множество копий определенного гена in vivo путем конструирования рекомбинантной ДНК и выращивания внутри бактерии-хозяина, в то время как ПЦР производит миллионы копий определенного фрагмента ДНК in vitro, подвергаясь повторяющимся циклам. денатурация и синтез.
Что такое клонирование генов?
Клонирование генов - это метод, используемый для обнаружения и размножения определенного гена из извлеченной геномной ДНК организма путем создания рекомбинантной ДНК. Геномная ДНК содержит тысячи различных генов, кодирующих белки. Когда ДНК извлечена, она включает в себя все возможные гены, которые она может нести. Метод клонирования генов позволил обнаружить определенный ген из общей ДНК. Поэтому клонирование генов служит важным инструментом молекулярной биологии.
Создание геномной библиотеки организма имеет важное значение при клонировании генов, если нет сведений о расположении соответствующего гена в ДНК. Геномная библиотека создается с помощью следующих шагов.
Шаг 1: Извлечение полной ДНК из организма, содержащего нужный ген.
Шаг 2: Рестрикционное переваривание извлеченной ДНК для получения небольших управляемых фрагментов. Этот этап облегчается эндонуклеазами рестрикции.
Шаг 3: Выбор подходящего вектора и вскрытие ДНК вектора с использованием тех же эндонуклеаз рестрикции. Бактериальные плазмиды обычно используются в качестве векторов для переноса чужеродной ДНК. Плазмиды представляют собой небольшие кольца ДНК, расположенные внутри бактерий.
Шаг 4: Объединение векторной ДНК и фрагментированной ДНК для получения рекомбинантной молекулы ДНК. Этот шаг регулируется ДНК-лигазой.
Шаг 5: Перенос молекул рекомбинантной ДНК в бактерии-хозяева. Этот шаг известен как трансформация и выполняется с помощью теплового шока.
Шаг 5: Скрининг трансформированных бактериальных клеток на культуральной среде. В конце процесса трансформации получают смешанную популяцию трансформированных и нетрансформированных клеток-хозяев. Поскольку интересующий ген включает только трансформированные клетки-хозяева. Следовательно, необходимо выбрать трансформированные клетки. Селекцию проводят с помощью селективных сред, содержащих антибиотики. Только трансформированные клетки растут на этой среде для скрининга, что позволяет проводить селекцию.
Шаг 6: Выращивание бактерий для создания генной библиотеки. На этом этапе трансформированные клетки-хозяева вводят в свежую культуральную среду, которая обеспечивает оптимальные требования для роста. Общее количество колоний на культуральных чашках представляет собой геномную библиотеку этого организма.
Шаг 7: Молекула рекомбинантной ДНК, содержащая интересующий ген, должна быть выделена из тысяч клонированных фрагментов рекомбинантной ДНК. Этого можно добиться с помощью зондов, которые маркируют конкретный ген или конкретный белок, полученный из этого гена.
Как только интересующий ген, содержащий бактериальную колонию, будет идентифицирован среди всех колоний, можно сделать миллионы копий рекомбинантной плазмиды, содержащей этот ген.
Клонирование генов используется для создания библиотек генов, производства специальных белков, витаминов, антибиотиков, гормонов, секвенирования и картирования геномов организмов, создания множественных копий ДНК отдельных лиц в криминалистике и т.д.
Рисунок_1: Клонирование генов
Что такое ПЦР?
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это метод, при котором создается большое количество копий определенного фрагмента ДНК. Экспоненциальную амплификацию определенной последовательности ДНК получают с помощью ПЦР в условиях in vitro. Этот метод является очень мощным инструментом в молекулярной биологии, поскольку он может умножить небольшой образец ДНК до количества, пригодного для использования. ПЦР была введена Кэри Маллисом в 1983 году, и это отмеченное наградами изобретение привело к огромному прогрессу в молекулярной биологии.
Техника ПЦР следует за повторяющимися реакциями ПЦР, как показано на рисунке 02. Одна реакция ПЦР состоит из трех основных стадий, протекающих при трех разных температурах; денатурация двухцепочечной ДНК при 94 0C, отжиг праймеров при 68 0C и удлинение цепи при 72 0 С. Таким образом, когда выполняется ПЦР, колебания температуры должны поддерживаться в высокой степени для правильной репликации. ПЦР проводится в ПЦР-аппарате внутри пробирок для ПЦР. Пробирки для ПЦР загружают правильными смесями для ПЦР, содержащими ДНК-матрицу, Taq-полимеразу, праймеры, dNTP и буфер. Денатурация двухцепочечной ДНК образца в одноцепочечную ДНК осуществляется путем разрыва водородных связей между комплементарными основаниями при 94 – 98°С. Затем отдельные нити матричной ДНК подвергают воздействию праймеров. Должна быть предусмотрена пара грунтовок (прямая и обратная), и они должны быть термостабильными, чтобы выдерживать высокие температуры. Праймеры представляют собой одноцепочечные короткие последовательности ДНК, комплементарные концам целевого фрагмента ДНК. Синтетические праймеры используются в ПЦР. Праймеры связываются с комплементарными основаниями ДНК образца и инициируют синтез новой цепи. Этот этап катализируется ферментом Taq-полимеразой; термостабильный фермент ДНК-полимераза, выделенный из Thermus auqaticus. Когда доступны праймеры и нуклеотиды (строительные блоки), Taq-полимераза конструирует новую цепь ДНК, комплементарную ДНК-матрице. В конце программы ПЦР амплифицированный фрагмент ДНК наблюдают с помощью гель-электрофореза. Если требуется дальнейший анализ, продукт ПЦР очищают от геля.
ПЦР очень полезна для диагностики и мониторинга генетических и приобретенных заболеваний, выявления преступников (в области криминалистики), изучения структуры и функции целевого сегмента ДНК, секвенирования и картирования геномов организмов, и т. д. ПЦР стала рутинным лабораторным методом в медицинских и молекулярно-биологических исследовательских лабораториях среди ученых, поскольку она имеет широкий спектр применений.
Рисунок_2: Полимеразная цепная реакция
В чем разница между клонированием генов и ПЦР?
Клонирование генов против ПЦР |
|
| Клонирование генов - это процесс создания множества копий определенного гена in vivo с помощью рекомбинантной ДНК и трансформации в бактерию-хозяина. | Техника ПЦР позволяет получить несколько копий определенной последовательности ДНК in vitro с помощью повторяющихся циклов реакций ПЦР. |
| Требование создания рекомбинантной ДНК | |
| Рекомбинантная ДНК производится для обнаружения гена. | Рекомбинантная ДНК не производится. |
| Потребность в рабочей силе | |
| Это трудоемкий процесс. | Интенсивного труда не требуется. |
| Процесс in vivo или in vitro | |
| Конструирование рекомбинантной ДНК in vitro и амплификация ДНК in vivo. | Амплификация ДНК происходит полностью in vitro. |
Резюме – Клонирование генов против ПЦР
Клонирование генов и ПЦР - два метода, используемые для амплификации ДНК. ПЦР - это процесс in vitro, в ходе которого создается множество копий ДНК определенного фрагмента ДНК без использования рекомбинантной ДНК и организма-хозяина. Клонирование генов - это, прежде всего, процесс in vivo, который приводит к множественным копиям интересующего гена внутри организма-хозяина посредством конструирования рекомбинантной ДНК. В этом разница между клонированием генов и ПЦР.
