Ключевая разница - клонирование и субклонирование
Клонирование и субклонирование - это молекулярно-биологические процедуры, которые создают генетически идентичные клетки или организмы, несущие интересующую ДНК или ген. Клонирование - это метод, который включает в себя вставку интересующего гена или ДНК в вектор, его репликацию в бактерии-хозяине и получение клеток или организмов, которые являются точными копиями генетического строения. Субклонирование - это метод, который включает вставку интересующего гена, уже встроенного в вектор, во вторичный вектор, его репликацию в бактерии-хозяине и получение генетически идентичных копий клеток или организмов. Ключевое различие между клонированием и субклонированием заключается в том, что при клонировании интересующий ген после лигирования в вектор продолжает процесс клонирования, в то время как при субклонировании уже клонированный интересующий ген отделяется от родительского вектора и снова вставляется в вектор. вектор получателя и продолжить процесс.
Что такое клонирование?
Клонирование – это процедура, при которой создаются генетически идентичные организмы или клетки. В природе клонирование происходит путем бесполого размножения. Когда нет генетической рекомбинации или изменения, дочерние клетки получают тот же генетический состав, что и родительские. Прокариотические и эукариотические организмы создают клоны путем бинарного деления, почкования, митоза и т. д. В молекулярной биологии клонирование генов или определенных фрагментов ДНК является популярным методом изучения структуры и функции этого конкретного участка ДНК.
Основной целью молекулярного клонирования является создание миллионов копий генетически идентичных клеток или организмов, несущих интересующий фрагмент ДНК (в основном гены). Он создает организмы с точными генетическими копиями другого. Прежде всего, в молекулярных исследованиях клонируют определенные гены для получения структурной и функциональной информации и для секвенирования ДНК. Кроме того, для производства определенных белков или продуктов в больших масштабах широко используется клонирование.
Процедура клонирования
Основные этапы процедуры клонирования следующие.
- Идентификация и выделение интересующего гена. (Амплификация интересующего гена методом ПЦР).
- Рестрикционное переваривание интересующего гена (Рестрикционная эндонуклеаза разрезает ген).
- Рестрикционное расщепление векторной ДНК. (Векторная ДНК также разрезается с помощью той же эндонуклеазы рестрикции).
- Вставка гена в вектор и формирование рекомбинантной молекулы.
- Трансформация рекомбинантного вектора в бактерию-хозяина.
- Выделение и идентификация трансформированных бактерий (плазмидный вектор должен содержать селективный ген, чаще всего ген устойчивости к антибиотикам для скрининга трансформированных бактерий).
- Рекомбинантная экспрессия генов в организме хозяина.
Рисунок_01: Процедура клонирования
Что такое субклонирование?
Субклонирование - это процедура перемещения интересующего гена из одного вектора в другой, чтобы увидеть экспрессию гена и получить желаемую функциональность гена. В этом методе задействованы два вектора; а именно, родительский вектор и вектор назначения. Клонированные вставки снова перемещаются во второй вектор при субклонировании. Цель переноса гена из первого вектора во второй вектор состоит в том, чтобы получить что-то, чего не мог сделать первый вектор, или снова выделить ген в уже клонированном фрагменте ДНК и экспрессировать его отдельно. Вначале в этой процедуре используются ферменты рестрикции.
Процедура субклонирования
Основные шаги субклонирования следующие.
- С помощью эндонуклеаз рестрикции выделение интересующей ДНК в донорной плазмиде (родительском векторе).
- Амплификация интересующей ДНК с помощью ПЦР.
- Очистка продукта ПЦР (целевой ДНК) с помощью гель-электрофореза.
- Открытие реципиентной плазмиды теми же рестрикционными эндонуклеазами, которые используются для выделения представляющей интерес ДНК в родительской плазмиде.
- Лигирование интересующей ДНК (гена) в реципиентную плазмиду для создания субклонированной плазмиды.
- Трансформация субклонированного вектора в компетентную бактерию-хозяина.
- Скрининг трансформированных клеток.
- Очистка плазмидной ДНК и ее использование для секвенирования ДНК или экспрессии генов для получения желаемых продуктов.
Субклонирование проводят в случаях выделения одного гена из клонированной группы генов или когда интересующий ген необходимо перенести в полезную плазмиду, чтобы увидеть точную функцию интересующего гена.
Рисунок_02: Процедура субклонирования
В чем разница между клонированием и субклонированием?
Клонирование против субклонирования |
|
| Клонирование – это процедура, при которой создаются генетически идентичные организмы или клетки. | Субклонирование - это процедура перемещения интересующего гена из одного вектора в другой, чтобы увидеть экспрессию гена и получить желаемую функциональность гена. |
| Процесс | |
| Выделяют интересующую ДНК из организма, один раз вставляют в вектор и клонируют | Уже клонированная ДНК отделяется от первого вектора, вставляется во второй вектор и клонируется. |
| Вставить движение через векторы | |
| Не перемещает вставки (искомую ДНК) из одного вектора в другой. | Переместить вставки из родительского вектора в целевой вектор. |
Резюме – Клонирование и субклонирование
Клонирование создает генетически идентичные клетки или организмы со вставленным интересующим геном или ДНК. Это происходит путем разделения и встраивания интересующей ДНК в вектор и экспрессии в бактерии-хозяине. Субклонирование имеет те же шаги, что и клонирование. Однако при субклонировании уже клонированный фрагмент ДНК (целевой ген) встраивается в вектор и трансформируется в бактерию-хозяина. В этом ключевое различие между клонированием и субклонированием.
